GlnR和Fnr介導(dǎo)植物乳桿菌WU14的Nir表達(dá)調(diào)控機(jī)制

第1章緒論001
1.1亞硝酸鹽與食品001
1.1.1亞硝酸鹽在食品行業(yè)的應(yīng)用001
1.1.2亞硝酸鹽對(duì)人體的危害001
1.1.3醬腌菜和泡菜中亞硝酸鹽的產(chǎn)生與控制002
1.2亞硝酸鹽還原酶002
1.2.1亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鹽途徑002
1.2.2亞硝酸鹽還原酶的分類003
1.2.3亞硝酸鹽還原酶的功能003
1.3植物乳桿菌003
1.3.1植物乳桿菌的功能004
1.3.2植物乳桿菌的脫氮能力004
1.3.3植物乳桿菌在醬腌菜和泡菜中的應(yīng)用004
1.3.4植物乳桿菌WU14005
1.4細(xì)菌氮代謝研究005
1.4.1調(diào)控因子與啟動(dòng)子的相互作用005
1.4.2GlnR調(diào)控因子006
1.4.3Fnr調(diào)控因子010
1.4.4Fnr調(diào)控因子對(duì)細(xì)菌氮代謝的調(diào)控010
1.4.5luxS和HK等全局性調(diào)控因子對(duì)亞硝酸鹽代謝的調(diào)控010
1.5植物乳桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系011
1.5.1國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展011
1.5.2工業(yè)應(yīng)用011
參考文獻(xiàn)012
第2章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14的Nir食品級(jí)高效誘導(dǎo)表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究020
2.1亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14對(duì)亞硝酸鹽降解能力分析021
2.2Nir基因克隆和生物信息學(xué)分析022
2.3重組質(zhì)粒pRNA48-Nir的構(gòu)建及Nir誘導(dǎo)表達(dá)026
2.4植物乳桿菌WU14的基因組測(cè)序和分析029
2.5結(jié)論030
參考文獻(xiàn)030
第3章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14中GlnR與Nir相互作用研究032
3.1Trans 1/pET-30a/Nir表達(dá)載體的構(gòu)建與檢測(cè)034
3.1.1亞硝酸鹽還原酶保守片段Nir的獲取034
3.1.2Nir誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建034
3.1.3Nir蛋白誘導(dǎo)與SDS-PAGE分析034
3.2植物乳桿菌GlnR基因克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建與檢測(cè)036
3.2.1T3-glnR構(gòu)建036
3.2.2pET-30a-glnR的表達(dá)載體構(gòu)建036
3.3GlnR與Nir啟動(dòng)子體外相互作用研究037
3.3.1pNir啟動(dòng)子基因擴(kuò)增及Trans1/T3/pNir菌落PCR驗(yàn)證037
3.3.2GlnR基因片段的重新獲得037
3.3.3誘餌載體與表達(dá)載體的構(gòu)建038
3.3.4細(xì)菌單雜交實(shí)驗(yàn)誘餌載體與表達(dá)載體酶切驗(yàn)證039
3.4結(jié)論043
參考文獻(xiàn)044
第4章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14中GlnR與Nir表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究046
4.1利用酵母雙雜交研究GlnR與Nir的互作與表達(dá)調(diào)控046
4.1.1亞硝酸鹽還原酶（Nir）基因和GlnR基因的克隆046
4.1.2GlnR-pGBKT7誘餌載體和報(bào)告載體Nir-pGADT7的構(gòu)建046
4.1.3菌落PCR檢測(cè)重組載體pAD-Nir和pBD-GlnR047
4.1.4融合載體的自激活和毒性檢測(cè)047
4.1.5亞硝酸鹽還原酶（Nir）和調(diào)控蛋白GlnR相互作用分析048
4.1.6植物乳桿菌WU14 RNA的提取048
4.2凝膠阻滯驗(yàn)證GlnR蛋白與Nir互作和表達(dá)調(diào)控049
4.2.1PCR擴(kuò)增GlnR基因050
4.2.2pPIC9-GlnR表達(dá)載體的構(gòu)建051
4.2.3SDS-PAGE分析重組載體pPIC9-GlnR的表達(dá)產(chǎn)物051
4.2.4pE-T30a-GlnR表達(dá)載體的構(gòu)建051
4.2.5GlnR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化052
4.2.6GlnR蛋白與亞硝酸鹽還原酶（Nir）的相互作用053
4.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析亞硝酸鹽脅迫GlnR對(duì)Nir的表達(dá)調(diào)控作用053
4.3.1WU14生長(zhǎng)曲線測(cè)定054
4.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）054
4.4結(jié)論057
參考文獻(xiàn)059
第5章Fnr參與植物乳桿菌WU14亞硝酸鹽降解的調(diào)控機(jī)制061
5.1Fnr和GlnR的重組表達(dá)和純化061
5.1.1fnr和glnR基因擴(kuò)增及序列分析061
5.1.2Fnr和GlnR克隆載體的構(gòu)建062
5.1.3Fnr和GlnR重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建063
5.1.4Fnr和GlnR重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和檢測(cè)064
5.2凝膠阻滯（EMSA）驗(yàn)證Fnr和GlnR與nir啟動(dòng)子的相互作用067
5.2.1PglnR和Pnir啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增生物素標(biāo)記067
5.2.2EMSA驗(yàn)證Fnr與Pnir啟動(dòng)子的互作068
5.2.3EMSA驗(yàn)證GlnR和Pnir啟動(dòng)子的互作069
5.2.4EMSA驗(yàn)證Fnr和PglnR啟動(dòng)子的互作069
5.3qRT-PCR驗(yàn)證fnr和nir的相對(duì)表達(dá)量070
5.3.1不同培養(yǎng)條件下植物乳桿菌WU14的生長(zhǎng)曲線070
5.3.2植物乳桿菌WU14降解NaNO2能力測(cè)試072
5.3.3植物乳桿菌WU14的RNA提取073
5.3.4RNA反轉(zhuǎn)錄074
5.3.5fnr和nir相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證074
5.4結(jié)論076
參考文獻(xiàn)078
第6章植物乳桿菌WU14 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶分子生物學(xué)、發(fā)酵工藝優(yōu)化及熱穩(wěn)定性分子改良079
6.1高產(chǎn)D-塔格糖植物乳桿菌WU14的L-AI基因的分析、食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)的研究080
6.1.1植物乳桿菌WU14生物轉(zhuǎn)化D-塔格糖分析081
6.1.2L-AI基因的擴(kuò)增與TA克隆081
6.1.3高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的核苷酸序列分析082
6.1.4高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析083
6.1.5高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白跨膜螺旋分析和信號(hào)肽分析084
6.1.6高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析084
6.1.7高產(chǎn)D-塔格糖植物乳桿菌WU14的L-AI酶學(xué)性質(zhì)研究085
6.1.8重組PCR技術(shù)去除植物乳桿菌WU14 L-AI基因中的NcoⅠ酶切位點(diǎn)088
6.1.9重組質(zhì)粒pRNA48-L-AI的構(gòu)建及驗(yàn)證090
6.1.10SDS-PAGE篩選nisin誘導(dǎo)L-AI基因表達(dá)的最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時(shí)間092
6.1.11L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重組菌的遺傳穩(wěn)定性分析094
6.1.12L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重組菌的L-AI酶學(xué)性質(zhì)研究095
6.2植物乳桿菌WU14高產(chǎn)D-塔格糖的發(fā)酵工藝優(yōu)化和分離提純研究098
6.2.1L-AI發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型研究098
6.2.2D-塔格糖分離純化的研究102
6.2.3硼酸鹽催化L-AI產(chǎn)D-塔格糖的研究106
6.3植物乳桿菌WU14的L-AI耐熱性分子改良108
6.3.1L-AI同源建模110
6.3.2突變位點(diǎn)的預(yù)測(cè)111
6.3.3突變體的表達(dá)112
6.3.4野生型及突變型L-AI最適溫度及熱穩(wěn)定性的測(cè)定112
6.3.5野生型及突變型L-AI最適pH及pH穩(wěn)定性的測(cè)定114
6.4結(jié)論114
參考文獻(xiàn)118
第7章植物乳桿菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)以及生物信息學(xué)分析122
7.1植物乳桿菌WU14的8個(gè)β-葡萄糖苷酶編碼基因的克隆123
7.2SDS-PAGE分析重組蛋白123
7.3目的基因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14和BglHW14的生物信息學(xué)分析125
7.3.1氨基酸序列分析、跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)125
7.3.2氨基酸序列比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析126
7.3.3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)128
7.3.4亞細(xì)胞定位128
7.4結(jié)論129
參考文獻(xiàn)129