基孔肯雅病毒理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南

目錄
第一部分　臨床和診斷病毒學(xué)　
第一章　基孔肯雅病毒進(jìn)化和流行病學(xué)　3　
1.1　引言　3　
1.2　病毒的傳播循環(huán)和媒介　3　
1.3　病毒的歷史和起源　4　
1.4　2004年以來(lái)基孔肯雅病毒的流行病學(xué)和感染傳播情況　5　
1.5　基孔肯雅病毒在西半球的感染情況　6　
1.6　結(jié)語(yǔ)　7　
參考文獻(xiàn)　7　
第二章　基孔肯雅病毒分子流行病學(xué)　10　
2.1　引言　10　
2.2　材料　12　
2.2.1　病毒RNA的提取　12　
2.2.2　一步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（One-step RT-PCR）　12　
2.2.3　聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳和純化　13　
2.2.4　測(cè)序反應(yīng)　13　
2.2.5　PCR測(cè)序產(chǎn)物的純化　13　
2.3 方法　14　
2.3.1　病毒RNA的提取　14　
2.3.2　一步法RT-PCR　14　
2.3.3　瓊脂糖凝膠電泳和純化PCR產(chǎn)物　14　
2.3.4　測(cè)序反應(yīng)　15　
2.3.5　純化循環(huán)測(cè)序產(chǎn)物　15　
2.3.6　測(cè)序數(shù)據(jù)編輯　16　
2.3.7　系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建　16　
2.4　注釋　16
參考文獻(xiàn)　17
第三章　高級(jí)遺傳方法學(xué)在基孔肯雅病毒進(jìn)化和傳播追蹤溯源研究中的應(yīng)用　19　
3.1　引言　19　
3.2　材料　20　
3.3　方法　20　
3.3.1　序列生成　21　
3.3.2　從公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲得序列　21　
3.3.3　多序列比對(duì)　21　
3.3.4　序列多態(tài)性和基因突變分析　22　
3.3.5　中值連接進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建　23　
3.3.6　生成一個(gè)時(shí)間尺度的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并通過(guò)BEAST軟件包計(jì)算目標(biāo)序列到最近的共同祖先的時(shí)間（tMRCA）以確定祖先的年代　24　
3.3.7　BEAST跟蹤輸出的可視化　26　
3.3.8　用BEAST系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)輸出方式構(gòu)建最大分支可信度樹(shù)　27　
3.3.9　一致最大分支可信度樹(shù)的可視化　27　
3.3.10　通過(guò)BEAST2軟件進(jìn)行系統(tǒng)地理學(xué)分析來(lái)確定病毒株時(shí)空傳播特點(diǎn)　27　
3.3.11　用SPREAD軟件使系統(tǒng)地理學(xué)輸出可視化　29　
3.4　注釋　29
參考文獻(xiàn)　32
第四章　基于合成肽的抗體檢測(cè)方法診斷有無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的基孔肯雅病毒感染　34　
4.1　引言　34　
4.2　材料　35　
4.2.1　單向電泳　35　
4.2.2　雙向電泳　36　
4.2.3　電洗脫　37　
4.2.4　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析　37　
4.2.5　多肽合成　37　
4.2.6　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）　38　
4.3　方法　38　
4.3.1　單向電泳　38　
4.3.2　雙向電泳　39　
4.3.3　電洗脫　41　
4.3.4　蛋白液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析　41　
4.3.5　多肽合成41　
4.3.6　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）　42　
4.4　注釋　43
參考文獻(xiàn)　44
第五章　E2糖蛋白在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞的表達(dá)和純化及其在血清學(xué)中的應(yīng)用　45　
5.1　引言　45　
5.2　材料　46　
5.2.1　昆蟲(chóng)表達(dá)組件的構(gòu)建　47　
5.2.2　Sf9細(xì)胞的維持及E2糖蛋白的瞬時(shí)表達(dá)　47　
5.2.3　在昆蟲(chóng)細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)E2糖蛋白　47　
5.2.4　穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的凍存　48　
5.2.5　自然分泌CHIKV-E2的純化　48　
5.2.6　基孔肯雅病毒的血清學(xué)診斷　48　
5.3　方法　48　
5.3.1　構(gòu)建昆蟲(chóng)表達(dá)組件　48　
5.3.2　Sf9細(xì)胞的維持和E2糖蛋白的瞬時(shí)表達(dá)　49　
5.3.3　E2糖蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)　50　
5.3.4　穩(wěn)定細(xì)胞的低溫保存　51　
5.3.5　純化自然分泌的CHIKV-E2蛋白　51　
5.3.6　CHIKV的血清學(xué)診斷　52　
5.4　注釋　53
參考文獻(xiàn)　54
第六章　基于血清學(xué)工具的CHIKV感染診斷方法　55　
6.1　引言　55　
6.2　材料　60　
6.3　方法　61　
6.3.1　血清樣品的準(zhǔn)備　61　
6.3.2　血清和病毒混合液的準(zhǔn)備　62　
6.3.3　細(xì)胞培養(yǎng)　62　
6.3.4　用中和過(guò)的病毒感染細(xì)胞　62　
6.3.5　計(jì)算結(jié)果　62　
6.4　注釋　62
參考文獻(xiàn)　63
第七章　使用咽拭子及尿液標(biāo)本診斷基孔肯雅病毒感染及其評(píng)價(jià)　65　
7.1　引言　65　
7.2　材料　66　
7.2.1　病毒檢測(cè)　66　
7.2.2　ELISA檢測(cè)IgM抗體　66　
7.2.3　體外病毒分離　67　
7.2.4　體內(nèi)病毒分離　67　
7.3　方法　67　
7.3.1　通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)和測(cè)序分析檢測(cè)病毒基因組　67　
7.3.2　IgM抗體捕獲-ELISA血清學(xué)檢測(cè)　68　
7.3.3　體外病毒分離　69　
7.3.4　體內(nèi)病毒分離　70　
7.4　注釋　70
參考文獻(xiàn)　71
第二部分　細(xì)胞培養(yǎng)、病毒復(fù)制和細(xì)胞反應(yīng)　
第八章　用蚊子細(xì)胞擴(kuò)增基孔肯雅病毒　75　
8.1　引言　75　
8.2　材料　76　
8.2.1　培養(yǎng)C6/36細(xì)胞　76　
8.2.2　病毒擴(kuò)增　76　
8.3　方法　76　
8.3.1　培養(yǎng)C6/36細(xì)胞　76　
8.3.2　病毒擴(kuò)增　77　
8.4　注釋　78　
參考文獻(xiàn)　79
第九章　基孔肯雅病毒感染的定量分析——病毒蝕斑試驗(yàn)　81　
9.1　引言　81　
9.2　材料　82　
9.3　方法　83　
9.3.1　收集用于蝕斑試驗(yàn)的樣本　83　
9.3.2　接種BHK-21細(xì)胞于24孔板　84　
9.3.3　蝕斑試驗(yàn)　84　
9.4　注釋　86
參考文獻(xiàn)　88
第十章　實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)與定量分析基孔肯雅病毒　90　
10.1　引言　90　
10.2　材料　91　
10.2.1　寡核苷酸序列　91　
10.2.2　病毒RNA提取　91　
10.2.3　常規(guī)RT-PCR　91　
10.2.4　PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及純化　92　
10.2.5　體外轉(zhuǎn)錄合成cDNA　92　
10.2.6　一步法SYBR Green I實(shí)時(shí)RT-PCR　92　
10.2.7　一步法TaqMan實(shí)時(shí)RT-PCR　92　
10.3　方法　92　
10.3.1　病毒RNA提取　93　
10.3.2　體外轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物的制備　93　
10.3.3　瓊脂糖凝膠電泳及PCR產(chǎn)物純化　93　
10.3.4　體外轉(zhuǎn)錄　94　
10.3.5　RNA轉(zhuǎn)錄物的純化　94　
10.3.6　總RNA產(chǎn)量的計(jì)算　94　
10.3.7　體外轉(zhuǎn)錄RNA拷貝數(shù)測(cè)定　95　
10.3.8　用于RNA絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建　95　
10.3.9　基于SYBR-Green I的實(shí)時(shí)RT-PCR的絕對(duì)定量　95　
10.3.10　基于TaqMan的實(shí)時(shí)RT-PCR的絕對(duì)定量　97　
10.3.11　定量未知樣本中CHIKV載量　97　
10.4　注釋　98
參考文獻(xiàn)　100　
第十一章　伊蚊的基孔肯雅病毒感染　102　
11.1　引言　102　
11.2　材料　103　
11.2.1　含CHIKV的血液（CHIKV血飼）　103　
11.2.2　蚊子感染　103　
11.2.3　從蚊子收集CHIKV　104　
11.2.4　處理采集的蚊子臟器　104　
11.3　方法　104　
11.3.1　準(zhǔn)備含病毒的血食物　104　
11.3.2　蚊子感染　105　
11.3.3　采集和處理受感染蚊蟲(chóng)的臟器　106　
11.3.4　處理采集的蚊蟲(chóng)組織器官　108　
11.4　注釋　108　
參考文獻(xiàn)　109　
第十二章　人工血食物感染蚊蟲(chóng)中CHIKV的分析　111　
12.1　引言　111　
12.2　材料　112　
12.2.1　蚊子的飼養(yǎng)　112　
12.2.2　制備含感染性CHIKV的血食物　113　
12.2.3　感染后蚊子的處理　113　
12.2.4　核酸的檢測(cè)與定量　114　
12.3　方法　115　
12.3.1　埃及伊蚊和白紋伊蚊群落的飼養(yǎng)　115　
12.3.2　蚊子感染性血飼流程　116　
12.3.3　暴露后蚊子處理：通過(guò)分析CPE檢測(cè)蚊子中的病毒　117　
12.3.4　暴露后蚊子處理：強(qiáng)迫唾液分泌　118　
12.3.5　CHIKV核酸檢測(cè)與定量　119　
12.4　注釋　119
參考文獻(xiàn)　121　
第十三章　基孔肯雅病毒生長(zhǎng)與熒光標(biāo)記：免疫熒光法檢測(cè)基孔肯雅病毒　122　
13.1　引言　122　
13.2　材料　123　
13.2.1　病毒生長(zhǎng)　123　
13.2.2　熒光顯微鏡　123　
13.2.3　使用IFA進(jìn)行血清學(xué)診斷　124　
13.2.4　流式細(xì)胞術(shù)　124　
13.3　方法　125　
13.3.1　細(xì)胞生長(zhǎng)　125　
13.3.2　熒光顯微鏡下確定病毒的生長(zhǎng)　125　
13.3.3　應(yīng)用IFA進(jìn)行血清學(xué)診斷　126　
13.3.4　流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定病毒生長(zhǎng)　127　
13.4　注釋　127　
參考文獻(xiàn)　128　
第十四章　用蔗糖密度梯度分離和制備基孔肯雅病毒樣本用于透射電鏡觀察　130　
14.1　引言　130　
14.2　材料　131　
14.2.1　CHIKV的分離與擴(kuò)增　131　
14.2.2　病毒純化　131　
14.2.3　負(fù)染色和免疫金標(biāo)記法　132　
14.3　方法　132　
14.3.1　分離CHIKV　132　
14.3.2　CHIKV滴定　133　
14.3.3　大規(guī)模擴(kuò)增CHIKV用于病毒純化　134　
14.3.4　聚乙二醇（PEG沉淀）純化病毒　134　
14.3.5　不連續(xù)的蔗糖梯度純化病毒　135　
14.3.6　負(fù)染法　136　
14.3.7　免疫膠體金標(biāo)記　136　
14.4　注釋　137　
參考文獻(xiàn)　138　
第十五章　酵母雙雜交篩選法研究病毒-宿主蛋白的相互作用　139　
15.1　引言　139　
15.2　材料　141　
15.2.1　GAL4 Y2H系統(tǒng)中使用的酵母菌株和質(zhì)?！?41　
15.2.2　培養(yǎng)基　141　
15.2.3　酵母轉(zhuǎn)化　142　
15.2.4　準(zhǔn)備酵母蛋白提取物　143　
15.2.5　BD病毒融合構(gòu)建物自激活的檢測(cè)　144　
15.2.6　病毒-宿主相互作用文庫(kù)的篩選　144　
15.2.7　酵母菌落PCR　144　
15.2.8　多重庫(kù)質(zhì)粒的排除　145　
15.2.9　限制性消化排除重復(fù)文庫(kù)質(zhì)?！?45　
15.